论文一种微孔板法检测食品中添加维生素B12含量方法是关于对写作微孔板论文范文与课题研究的大学硕士、相关本科毕业论文冲孔钢板网论文开题报告范文和相关文献综述及职称论文参考文献资料下载有帮助。
维生素B 12（V B 12）,又称钴胺素（Cobalamin）,是人体中非常重要的水溶性维生素之一,主要用于婴幼儿奶粉、谷物食品、保健食品、乳品和功能性饮料等食品中营养强化.目前针对食品中B12检测方法,国标有GB 5009.217《保健食品中维生素B12测定》、GB 5413.14《婴幼儿食品和乳品中维生素B12测定》,但由于食品成分复杂、存在多种干扰因素,因此化学分析法的应用受到限制,目前国际仍以微生物法作为首选方法.
虽然微生物法检测VB12具有较高的灵敏度和精确度,但GB5413.14方法,步骤繁琐、操作耗时、检测周期长、易受外部因素干扰等诸多问题.本文采用德国拜发公司微孔板法对婴幼儿配方奶粉、谷物米粉、含乳饮料、功能饮料等食品中添加VB12含量的测定,实验稳定性非常好.
材料和方法
材料和仪器：VitaFast Vitamin B12试剂盒（德国拜发P1002）、微量移液器20- 200μl；100- 1000μl（eppendorf）、50ml离心管,2.0 ml EP管、一次性无菌注射器（带0.2μm无菌滤膜）（Axygen）；生物安全柜（赛默飞世尔1374）、酶标仪（BioTek Instruments ELX808）、恒温培养箱（精宏GNP- 9270）、电热恒温水浴锅（精宏DK-8D）
实验方法.
（1）样品处理：称取1g（ml）样品（精确至0.001g）,加40 ml的无菌蒸馏水溶解,放于50 ml带盖离心管中,于95℃水浴锅保温30min,期间至少摇晃4- 5次.迅速放于4℃冰箱冷却至30℃以下,用无菌注射器吸取样品过滤0.45μm滤膜,取所需样品于2 ml离心管,稀释至所需倍数.
（2）制备标准溶液：表1为标准溶液的稀释梯度.按照说明书向B12标准品干粉的小瓶内加入适量无菌水,混匀.按表1顺序加无菌水、标准品和测定用培养基于2ml EP管,一式3份.测定培养基按照说明书加10ml无菌水,摇匀,95℃水浴5 min,期间振荡至少5次,迅速放于4℃冰箱冷却至30℃以下,用0.45um滤膜过滤待用.
（3）样品检测：取出所需微孔板条固定于板上,先加150ul培养基至各微孔中,然后依次加150 ul的标准品和样品至各微孔中,一式三份.用粘合箔盖住板条和微孔,用手将粘合箔平压,使其充分封闭微孔板条.
（4）培养：3 7℃黑暗条件下培育44h- 48h.
（5）测定：将微孔板倒置桌面上,振荡,使微生物溶解于培养基中.然后将微孔板翻回前置于桌面上,从对角线方向轻扯下粘合箔,务必另一只手按压放置在桌面上的微孔板,以防止粘合过紧撕扯带起微孔板.用酶标仪630nm条件下读取数值.
结果和分析
绘制标准曲线：以维生素B12含量为横坐标,吸光度值为纵坐标,绘制标准曲线.如图1,试剂盒标准曲线在0.03- 0.18ug/100g范围内线性均良好,相关系数为1,检测限可达到0.03ug/100g
重复性：选取配方乳粉（2份）、配方米粉、含乳饮料、功能饮料为试验样品,每个样品作6次平行试验,测试结果见表2,5种样品6次平行测试的RSD在3.9%- 6.9%之间,说明重复性良好.
加标回收率：选择已知维生素B12含量的标准品加入同一乳粉中,加标量分别为250.0ng,150.0ng,100.0ng,进行3次重复试验,结果如表3,回收率为94.2%- 100.8%,试验灵敏度较高.
小结和讨论
应用微生物法检测维生素B12,其准确度和灵敏度取决于试验中乳杆菌数量、活力、培养基、样品处理方式以及人员操作等因素.商品化试剂盒通过一定工艺水平将菌株固定在微孔板上,减少菌株活力、培养基等造成的误差,但操作中仍需要注意,1.标准曲线的绘制直接影响实验结果,因为微生物生长是非线性的,随着VB12浓度增加,吸光度的增长渐缓慢；2.使用Ridawin数据处理软件,采用多項式曲线拟合法绘制标准曲线更符合菌株的实际生长情况；3.需无菌操作,移液器枪头、离心管、过滤膜等需提前灭菌,以避免外来微生物的污染.本文采用微孔板法测试5种食品添加的VB12,定量限在0.03- 0.18ug/100g（ml）范围内线性良好,相关系数为1,重复性试验中,样品的平行性较好,相对标准偏差在3.9% - 6.9%,加标回收率在94.2% -100.8%,相对繁琐的国标方法,微孔板法是一种操作简单、快捷、准确度和重复性良好,适合各实验室推广应用.
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参考文献：
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