论文环介导等温扩增技术对锦鲤疱疹病毒的快速检测是关于本文可作为相关专业锦鲤疱疹病毒论文写作研究的大学硕士与本科毕业论文锦鲤疱疹病毒论文开题报告范文和职称论文参考文献资料。
摘 要：为建立一种快速检测锦鲤疱疹病毒（CyHV-3）的环介导等温扩增方法（LAMP）,本研究根据GenBank中登录的CyHV-3 TK基因编码区序列设计了LAMP特异性引物,通过优化反应条件,建立了检测CyHV-3的LAMP方法.表明本实验建立的该检测方法具有高灵敏度、高特异性、快速和简便的特性,适用于临床上对锦鲤疱疹病毒3的快速诊断.
关键词：LAMP；CyHV-3；快速检测
0 引言
锦鲤疱疹病毒病是由鲤疱疹病毒3型Cyprinid herpesvirus 3（CyHV-3）感染引起鲤鱼、锦鲤以及普通变种鳃坏死和间质性肾炎的一种高致病性、高传染性、高死亡率疾病.现已在全世界范围内流行,严重威胁着鲤鱼和锦鲤养殖业的发展.
目前,已经建立的对CyHV-3的检测方法有DNA杂交、PCR、套式PCR、荧光定量PCR和环介导等温扩增方法（loop-mediatedisothermal amplification,LAMP）等.以上检测方法在临床检测中均存在局限,如仪器设备,技术人员和成本等.LAMP检测方法对仪器要求低,根据颜色变化通过肉眼可以对结果进行判断,适用于现地检测.
1 材料与方法
1.1 主要实验材料
含有CyHV-3 TK基因的重组质粒,Bst DNA聚合酶（长片段）、Thermopol II反应缓冲液,SYBR Green I荧光染料,Betaine,dNTP,DNAMarker,病毒DNA提取试剂盒,
1.2 引物设计
根据中华人民共和国水产行业标准中,鲤疱疹病毒检测方法要求的CyHV-3的TK基因的序列,使用Primer Explorer V4设计8条特异性引物（表1）,并交由上海生工合成.
1.3 LAMP扩增
LAMP反应体系：1μl F3/F3’（10μM）,1μl B3/B3’（10μM）,1μl FIP/FIP’（50μM）,1μl BIP/BIP’（50μM）,4μl dNTPs（25mM）,4μl 10xThermopol buffer,8U BstDNA聚合酶,3μl Betaine（0.8M）,2.5μl MgCl2（25mM）,2μl模板DNA和4.5μl ddH2O,石蜡密封液面,之后加入2μlSYBR Green I,65℃孵育60min,80℃10min灭活酶终止反应.
反应管淡绿色为阳性,淡橘为阴性.结果判定采用琼脂糖凝胶电泳检测.
1.4 LAMP反应条件优化
分别通过不同温度以及不同时间进行LAMP扩增,优化dNTPs、Betaine、MgCl2等其他反应条件.
2 结果
LAMP的建立和检测：以特异性引物对CyHV-3进行LAMP扩增,肉眼观察,CyHV-3阳性管浑浊.而阴性管未见浑浊,加入荧光染料SYBR Green I后,CyHV-3阳性管反应液变为淡绿色,而阴性对照管为棕色.
琼脂糖凝胶电泳检测结果显示,CyHV-3阳性管出现典型的梯形条带,而阴性管没有产生条带.
经优化后,LAMP体系最佳反应时间为40min,最佳反应温度为65℃,dNTPs最适浓度为1.2mM、Betaine最佳浓度为0.8mM、MgCl2最佳浓度为8mM.
3 讨论
自从锦鲤疱疹病毒发现以来,各个地区几乎每年都有流行.目前,锦鲤疱疹病毒病的全球性暴发,给锦鲤观赏业、鲤鱼养殖业以及国际贸易造成了严重的经济损失.
PCR是目前较为精确检测CyHV-3感染的方法.Bercovier等基于CyHV-3的胸苷激酶基因建立的PCR方法,能够区分CyHV-3与CyHV-1和CCV.刘荭等建立了nestedPCR,已作为我国检测CyHV-3的标准方法.范万红等建立的实时荧光定量PCR缩短了检测时间,适用于进出口检验检疫.LAMP法是一种新式恒温核酸扩增方法,该扩增法具有简便、快速、准确、廉价、易检测等特点.Gunimaladevi等基于TK基因设计引物,建立了快速检测CyHV-3的LAMP法.Soliman等在产物中加入SYBR GreenⅠ,根据其颜色的变化来判定结果,从而更加直观.LAMP检测法不需要特殊的仪器设备,适合现场诊断.因此LAMP法具有良好的应用前景.
本实验建立的LAMP方法具有以下特点：第一速率快,仅40min左右即達到反应的平台期；第二、对反应装置要求较低,恒温水浴锅、PCR仪均能作为LAMP的恒温反应装置；第三、结果观察简单,添加SYBR Green I核酸染料后肉眼即可观察.本文提供了稳定的CyHV-3检测体系,为控制CyHV-3的流行与及时检测提供了技术支持.
致谢
本研究由河北省研究生创新项目提供资金支持
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总结:本论文主要论述了锦鲤疱疹病毒论文范文相关的参考文献,对您的论文写作有参考作用。
参考文献：
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